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問題		可能的解決方案）
一抗和二抗可能不匹配。		建議二抗針對產(chǎn)生一抗的物種（例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則使用抗小鼠二抗）。
該抗體可能不適用于以天然（非變性）形式顯示蛋白質(zhì)的 IHC 程序。		在非變性和變性蛋白質(zhì)印跡上測試抗體，以確?？贵w識別非變性抗原。
二抗未避光保存。		建議避免將二抗暴露在光線下。
沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。		減少抗體稀釋。在 4°C 下孵育更長時(shí)間。
感興趣的蛋白質(zhì)并不大量存在于組織中。		運(yùn)行陽性對照。利用放大步驟可以幫助放大信號。使用較低稀釋度的一抗。
目標(biāo)蛋白是核蛋白，抗體不能穿透細(xì)胞核。		為了促進(jìn)細(xì)胞核的滲透，在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。
脫蠟可能不夠		將切片脫蠟時(shí)間更長。使用新鮮制備的二甲苯。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會改變抗體識別的表位。		使用抗原修復(fù)方法揭露表位。修復(fù)時(shí)間更短。
PBS 緩沖液可能被細(xì)菌污染，這些細(xì)菌已經(jīng)破壞了目標(biāo)蛋白質(zhì)。		在 PBS 抗體儲存緩沖液中使用防腐劑，如 0.01% 疊氮化物。使用新鮮的無菌 PBS。

問題		可能的解決方案）
非特異性結(jié)合的阻斷可能是不夠的。		將切片的封閉潛伏期延長至 30 分鐘，將細(xì)胞培養(yǎng)延長至 1 小時(shí)。使用封閉劑，例如 10% 正常血清用于切片，1-5% BSA 用于細(xì)胞培養(yǎng)。
一抗?jié)舛瓤赡芴摺?/td>		將抗體滴定至更佳濃度，使用更多稀釋液孵育更長時(shí)間。這將提供更慢但更具體的綁定。
二抗可能非特異性結(jié)合。		在沒有一抗的情況下運(yùn)行二級對照。
孵化溫度可能太高。		在 4°C 下孵育組織切片或細(xì)胞。
組織未充分洗滌。		在所有步驟之間用 PBS *清洗
內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強(qiáng)，可能已經(jīng)改變了抗體識別的表位。		改變抗原修復(fù)方法。減少抗原暴露溶液的孵育時(shí)間。
應(yīng)用了過多的基材。		減少底物孵育時(shí)間。
色原與細(xì)胞中存在的 PBS 發(fā)生反應(yīng)。		在與底物一起孵育之前，使用 Tris 緩沖液清洗切片。
透化已經(jīng)損壞了膜并去除了膜蛋白。		從緩沖液中去除通透劑。

問題		可能的解決方案）
一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。		將信號強(qiáng)度與不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞進(jìn)行比較。
一抗是針對與染色組織相同的物種產(chǎn)生的（例如在大鼠組織上測試的大鼠一抗）。		當(dāng)應(yīng)用二抗時(shí)，它會與所有組織結(jié)合，因?yàn)樗彩轻槍υ撐锓N產(chǎn)生的。使用針對與您的組織不同的物種產(chǎn)生的一抗/二抗。
內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
切片/細(xì)胞已變干。		將組織切片和細(xì)胞保持在高濕度下，不要讓它們變干。

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