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陽(yáng)離子脂質(zhì)體傳統(tǒng)上用于傳遞遺傳物質(zhì)，例如各種類型的DNA（pDNA，cDNA，CpG DNA，寡核苷酸，反義寡核苷酸等），各種類型的RNA（例如siRNA，mRNA等）和核酸酸模擬物（NAM）。 將DNA封裝到常規(guī)的中性帶電荷的基于PC的脂質(zhì)體中可能是一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，主要是由于質(zhì)粒的大小。由于這個(gè)問(wèn)題在80年代后期，已經(jīng)開發(fā)了由陽(yáng)離子脂質(zhì)和PE組成的脂質(zhì)體。這個(gè)想法是用陽(yáng)離子脂質(zhì)的正電荷中和pDNA的負(fù)電荷，以便主要由于靜電相互作用有效地捕獲更多質(zhì)粒并將其傳遞到細(xì)胞中。通常，該程序僅基于將陽(yáng)離子脂質(zhì)體與DNA或RNA混合并將其添加到細(xì)胞中即可。這導(dǎo)致骨料的配方。
為了設(shè)計(jì)合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)用于基因傳遞，已將兩種方法用于陽(yáng)離子脂質(zhì)合成：1）基于膽固醇的設(shè)計(jì)，例如DC-膽固醇和GL-67脂質(zhì)，以及2）非基于膽固醇的設(shè)計(jì)，例如作為DOTAB，DDAB和DOTMA。 為了使用脂質(zhì)體在體外成功轉(zhuǎn)移基因，應(yīng)考慮一些因素： i）結(jié)合和包裝脂質(zhì)體中DNA / RNA的能力； ii）包裝的DNA / RNA與細(xì)胞表面的相互作用； iii）DNA / RNA內(nèi)在化的效率； iv）萬(wàn)一發(fā)生內(nèi)吞作用，從內(nèi)體釋放細(xì)胞內(nèi)DNA； v）細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。 已根據(jù)其在酸性條件下釋放其含量的趨勢(shì)設(shè)計(jì)了對(duì)pH敏感的脂質(zhì)體。主要概念基于病毒，該病毒通過(guò)pH 5-6的蛋白質(zhì)與內(nèi)體膜融合，并在到達(dá)溶酶體之前將其遺傳物質(zhì)傳遞到細(xì)胞質(zhì)中。 通常，pH敏感脂質(zhì)體由二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）組成。由于磷脂酰乙醇胺（PE）在酸性條件下會(huì)發(fā)生變化，因此據(jù)信它可以充當(dāng)膜融合促進(jìn)劑。 脂質(zhì)體與細(xì)胞之間相互作用的有效性高度依賴于脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體通過(guò)各種內(nèi)吞過(guò)程捕獲，效率取決于細(xì)胞類型和脂質(zhì)體大小。各種大小和電荷的脂質(zhì)體可通過(guò)吞噬作用附著于巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。脂質(zhì)體附著到細(xì)胞表面后，由于早期內(nèi)體的酸性更高（6.50），內(nèi)化進(jìn)入內(nèi)體。通過(guò)成熟或囊泡融合將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到酸性更高的pH（5.5-6.0）的后一個(gè)內(nèi)體，這需要10-15分鐘。攝取后二十分鐘（或更長(zhǎng)時(shí)間），內(nèi)含物被遞送至pH 5.0或更低的溶酶體。溶酶體是內(nèi)吞途徑中主要的降解和后的內(nèi)吞區(qū)段，pH不敏感的脂質(zhì)體在其中積累和降解。但是，在pH敏感脂質(zhì)體滲透到細(xì)胞中后，不會(huì)發(fā)生積累和降解。
有關(guān)上述脂質(zhì)體脂質(zhì)組成的更多信息，請(qǐng)單擊此處。
| 緩沖液和脂質(zhì)體大小 | 規(guī)格 |
|---|---|
| 緩沖 | 去離子無(wú)核糖核酸水 |
| pH值 | 7 |
| 脂質(zhì)體大小 | 100納米 |
| 熒光染料 | 激發(fā)/發(fā)射（nm） | 分子結(jié)構(gòu) |
|---|---|---|
| 1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽（DiI） | 549/565 |  |
| 3,3'-二亞油基氧雜碳菁高氯酸鹽（DiO） | 484/501 |  |
| 1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基）（銨鹽） | 460/535 |  |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（lissamine羅丹明B磺?；ㄤ@鹽） | 560/583 |  |
基于陽(yáng)離子胺氮（在陽(yáng)離子脂質(zhì)中）和DNA磷酸基團(tuán)濃度計(jì)算正負(fù)電荷之比。 DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它們通過(guò)磷酸二酯鍵（一種特定類型的共價(jià)鍵）結(jié)合在一起，該磷酸二酯鍵可以長(zhǎng)到數(shù)百萬(wàn)個(gè)核苷酸。由于存在構(gòu)成每個(gè)核苷酸的磷酸根基團(tuán)（戊糖+含氮堿基+磷酸根），DNA和RNA帶負(fù)電。當(dāng)形成磷酸二酯鍵的一部分時(shí)，它們保留2個(gè)負(fù)電荷中的1個(gè)。失去另一個(gè)負(fù)電荷以形成與新戊糖的另一個(gè)酯鍵。這就是將該鍵稱為“磷酸二酯”的原因。例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP具有以下結(jié)構(gòu)。
DOTAP具有一個(gè)氮，因此每個(gè)分子帶一個(gè)正電荷。1納摩爾的DOTAP可貢獻(xiàn)1納摩爾的正電荷。一些陽(yáng)離子脂質(zhì)含有一個(gè)以上的氮，但并非所有的氮原子都帶有正電荷。對(duì)于其他脂質(zhì)，請(qǐng)查看它們的分子結(jié)構(gòu)以找到分子中氮原子的數(shù)量。
RNA與DNA不同，是單鏈分子。但是，siRNA是雙鏈的。例如，在一個(gè)長(zhǎng)21 bp的siRNA分子中，由于堿基對(duì)中有2個(gè)核苷酸，并且每個(gè)核苷酸帶有一個(gè)負(fù)電荷，因此存在42個(gè)負(fù)電荷。
1 µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負(fù)電的磷酸鹽。
魚精蛋白是一種高度帶正電荷的聚陽(yáng)離子肽，分子量為5.1 kDa，可作為DNA縮合試劑。已知魚精蛋白是精子核中用于濃縮DNA的主要成分。所有魚精蛋白都含有精氨酸，并且是強(qiáng)堿性的（等電點(diǎn)= 11-12）。
由脂質(zhì)魚精蛋白-DNA（LPD）組成的脂質(zhì)多聚體是通過(guò)魚精蛋白預(yù)壓縮的DNA與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的結(jié)合而產(chǎn)生的。這與通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)和DNA之間直接靜電相互作用形成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)復(fù)合物相反。脂質(zhì)魚精蛋白-DNA具有凈正表面電荷，據(jù)信對(duì)于其與陰離子細(xì)胞表面蛋白聚糖的結(jié)合是*的。細(xì)胞表面的這種靜電相互作用觸發(fā)脂質(zhì)-DNA復(fù)合物的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。
向DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)體中添加魚精蛋白的順序非常重要。一種方案涉及將質(zhì)粒DNA與硫酸魚精蛋白預(yù)復(fù)合，然后添加陽(yáng)離子脂質(zhì)體。該協(xié)議有兩個(gè)缺點(diǎn)。其中之一是需要大量過(guò)量的陽(yáng)離子脂質(zhì)才能實(shí)現(xiàn)大水平的基因表達(dá)。通常，陽(yáng)離子脂質(zhì)/ DNA摩爾比必須大于35，才能有效體內(nèi)轉(zhuǎn)染。另一個(gè)問(wèn)題是難以制備濃縮樣品。這是由于魚精蛋白硫酸鹽與質(zhì)粒DNA的強(qiáng)烈相互作用，這使得高濃度魚精蛋白/ DNA復(fù)合物的制備變得困難，尤其是在需要高魚精蛋白/ DNA比（w / w）的情況下。為了解決這些問(wèn)題，已經(jīng)開發(fā)了第二種方案，其中將硫酸魚精蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合，然后添加質(zhì)粒DNA。由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體和魚精蛋白之間競(jìng)爭(zhēng)與質(zhì)粒DNA的相互作用，大大降低了魚精蛋白和DNA之間的強(qiáng)相互作用。在一定條件下，這將導(dǎo)致形成平均直徑小于150 nm的LPD。
為了計(jì)算正負(fù)比率，您需要考慮：
聚乙二醇化已在脂質(zhì)體學(xué)領(lǐng)域廣泛使用了數(shù)十年。聚乙二醇化的好處是*的，包括改善脂質(zhì)復(fù)合體的系統(tǒng)循環(huán)。然而，脂質(zhì)復(fù)合體的PEG化的缺點(diǎn)也已經(jīng)被很好地證明。這包括防止脂質(zhì)復(fù)合物與靶細(xì)胞締合以及抑制DNA從內(nèi)體區(qū)室釋放，這導(dǎo)致非常低的轉(zhuǎn)染效率。
隨著摻入陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的PEG化脂質(zhì)的分子量增加，陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性增加。例如，含有PEG5000的脂復(fù)合物比含有PEG2000的脂復(fù)合物更具細(xì)胞毒性。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活性隨PEG-DSPE脂質(zhì)百分比的增加而降低。先前的研究表明，添加0.5％PEG-PE會(huì)使肺中的原始熒光素酶活性降低至原熒光素酶活性的60％，1％降低至40％，2％降低至10％。還據(jù)報(bào)道，將PEG-PE（1％的陽(yáng)離子脂質(zhì)）添加到新形成的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物中可以防止復(fù)合物在儲(chǔ)存期間聚集。但是，將含有PEG-PE的復(fù)合物在4°C下儲(chǔ)存會(huì)緩慢恢復(fù)其原始活性。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，不使用聚乙二醇化。但是，在某些實(shí)驗(yàn)中，尤其是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用了聚乙二醇化的脂質(zhì)復(fù)合物。
如果您需要進(jìn)行涉及陽(yáng)離子脂質(zhì)體聚乙二醇化的實(shí)驗(yàn)，那么強(qiáng)烈建議首先通過(guò)將適量的遺傳物質(zhì)添加到脂質(zhì)體中，然后在外部添加聚乙二醇化脂質(zhì)（插入后）并孵育脂質(zhì)體來(lái)形成脂質(zhì)復(fù)合物。然后將PEG脂質(zhì)在高于陽(yáng)離子脂質(zhì)的液相到凝膠相轉(zhuǎn)變溫度的溫度下放置1小時(shí)（如果是不飽和陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如DOTAP，則可以在室溫下孵育）。
在許多實(shí)驗(yàn)中，不是使用傳統(tǒng)的PEG2000-DSPE，而是將C8-PEG2000-神經(jīng)酰胺用于脂質(zhì)體的PEG化，因?yàn)镻EG-神經(jīng)酰胺是“脫落的PEG”，在與生物膜接觸時(shí)會(huì)從脂質(zhì)體中擴(kuò)散出來(lái)。
由于脂質(zhì)體制劑中使用的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有細(xì)胞毒性，因此強(qiáng)烈建議進(jìn)行細(xì)胞生存力分析。可以通過(guò)改良的Alamar藍(lán)分析法評(píng)估細(xì)胞活力。阿拉瑪藍(lán)含有氧化還原指示劑，該指示劑在細(xì)胞代謝的氧化還原范圍內(nèi)均顯示熒光變化。簡(jiǎn)而言之，將10μL的10％（v / v）Alamar藍(lán)色染料添加到100μL樣品中。在37ºC下孵育2小時(shí)后，在熒光分光光度計(jì)上在570 nm和600 nm上讀取所得的熒光。使用以下公式計(jì)算細(xì)胞活力（對(duì)照細(xì)胞的百分比）：
PlainGenesome®是由納米級(jí)單層脂質(zhì)體制成的白色半透明液體。FluorescentGenesome®制劑帶有顏色，其顏色取決于所用熒光染料的類型（有關(guān)外觀，請(qǐng)參見SDS）。通常由于脂質(zhì)體小，在小瓶底部不會(huì)發(fā)生沉淀。將脂質(zhì)體包裝在琥珀色的小瓶中。
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